HPLC: Spet dodatni vrh v kromatogramu: tokrat je krivec kisik!

16. junij 2008 · Objavljeno v Analitika · Komentar 

Ko na naših HPLC izobraževanjih iščemo kandidate za dodatne vrhove skoraj nihče ne pomisli za pline. Pa vendar so lahko krivi tudi raztopljeni plini.

V tem prispevku pa bi se rad dotaknil še enega vira dodatnih vrhov, ki pa niso posledica našega “packanja”, pač pa izhajajo iz vsebnosti raztopljenega kisika v naših vzorcih.

Mobilno fazo skrbno razplinimo kajne? Kaj pa topilo, vzorec in standard? Teh seveda ne. In tako se nam zgodi, da je vsebnost raztopljenega kisika v topilu, vzorcu in standardu višja kot v mobilni fazi. In kisik se (menda v kompleksu z metanolom) tudi zadrži na koloni. Pri mobilni fazi voda:metanol (50:50 V/V) je zadrževalni čas kisika okoli 4,2 minute na C-18 koloni 150 x 4,6 mm, pri pretoku 1,0 ml/minuto (k’ je priblično 1,8). Pri 210 nm se pri primerni občutljivosti detektorja vidi prav lep vrh.

Kako lahko ugotovimo, da naš vrh izhaja iz kisika?

Povečanje ali zmanjšanje kisika v vzorcu, bi povečalo ali zmanjšalo vrh kajne? Predlagam, da močno stresete vzorec in s tem vnesete dodaten kisik v vzorec. Sumljivi vrh bi se moral povečati. Seveda pa lahko uberete drugo, težjo pot; da razplinite vzorec in sumljivi vrh bi se moral zmanjšati.

Kako si pomagati?

  • Če dodatni vrh ne moti, kvantitativnega določanja naših komponent, ga enostavno pustimo pri miru. Če izvedemo zgoraj opisani test pač vemo, da izhaja iz kisika in ne iz našega vzorca in tudi ni posledica naših “packarij”.
  • Če je vrh velik in moti določanje naših komponent, lahko zmanjšamo razplinjevanje mobilne faze. S tem vrh kisika zmanjšamo na bolj primerno velikost. Seveda, če naše črpalke prenesejo povečano vsebnost kisika v mobilni fazi. Nekatere so bolj občutljive kot druge.
  • Ena od mogočih rešitev bi bila, da bi razplinili vzorec. Tudi to ni preveč priporočljivo, kajti z razplinjevanjem bi lahko skoncentrirali vzorec (odparevanje topila), kar seveda vpliva na rezultat.
  • Še ena možnost obstaja na katero pa je treba misliti prej - pri razvoju metode. Kisik je namreč veliko bolj topen v metanolu kot v acetonitrilu, zato lahko zamenjamo metanol v mobilni fazi z ustreznim deležem acetonitrila. In seveda ohranimo enako polarnost mobilne faze.

Prav pametnih in učinkovitih rešitev ni na razpolago, ne da bi imeli veliko dela ali pa da bi vplivali na verodostojnost analitskih rezultatov. Upam pa, da sem vsaj opozoril na še enega kandidata za dodatne vrhove v naših kromatogramih. Morda si pa pri kakšnem primeru ne boste tako razbijali glave z neželjenim vrhom.

Aleš Čerin

Kliknite in delite naprej: bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark

Sorodne vsebine

HPLC: O čistoči v laboratoriju …

22. april 2008 · Objavljeno v Analitika · Komentar 

HPLC je kompleksna analitska tehnika. Kljub izrednemu tehničnemu napredku, so težave na HPLC še vedno zanimiva tema kajne? Vedno je kaj, kar preseneti še tako izkušenega analitika.

Danes pa ne bom govoril o težavah na HPLC, pač pa o preprečevanju težav na HPLC. To je zelo široka tema. Pišem namreč o temi, za katero menim, da je osnova za preprečevanje težav na HPLC: o čistoči v laboratoriju. O njej se med kromatografisti ne govori veliko. Tudi sicer ne maramo preveč “sistemov za zagotavljanje čistoče” ali pa se z njimi sploh ne želimo ukvarjati.

Ta tema je še posebno pomembna ko analiziramo:

  • nizke koncentracije snovi,
  • pri nizkih valovnih dolžinah (UV detekcija) in še posebej pri
  • gradientni HPLC analitiki.

Dejstva: HPLC je kromatografska tehnika, ki ločuje komponente med seboj (ali pa tudi ne, včasih pripomnijo hudomušni). Na kromatogramu se vidi vse, kar naš detektor zazna. Tudi snovi, ki nekako “priletijo” v našo raztopino od kdovekod.

Od kod pa lahko “priletijo” neznani vrhovi?

Pomislimo na vse možnosti. Torej, vse kar je v stiku z našim vzorcem (ali standardom), ga lahko tudi onesnaži. S čim vse pa je v stiku vzorec in kaj se lahko zgodi?

Pa poglejmo vzorec (večina stvari velja tudi za standard) na poti od vzorčenja do kolone in si zastavimo zanimiva vprašanja:

  • Vzorčenje: S čim vzorčimo in v kaj vzorčimo (čistoča posod in pribora)? Ali je vzorec trden ali tekoč? Ali vzorec lahko kaj “potegne” iz posode v katero smo vzorčili?
  • Topilo za pripravo vzorca: Kakovost topil: ali lahko kaj prispevajo v raztopino, kar se vidi na kromatogramu? Čistoča posode za pripavo topila? Kje jo hranimo? Ali uporabljamo isto (ne samo enako!) topilo za standard in za vzorec?
  • Priprava vzorca: Ali preprečimo dostop prahu, da se useda na naš vzorec? V ilustracijo si poglejmo primer: Predstavljajte si zelo trde tablete, ki jih je pomočjo terilnice in pestila treba streti v fin prah. Treti je treba zelo intenzivno. Pri tem koščki tablet včasih dobesedno “skačejo” po okolici. Tudi v sosedovo terilnico, v kateri je imel zmlet svoj vzorec. In že imamo dodatne vrhove v kromatogramu.
  • Filtriranje: Ali imamo kakovostne filtre, ki ne odpuščajo? Kje jih hranimo? Ali jih hranimo zaprte, da se na njih ne nabira prah iz laboratorija? Ali zavržemo prvi filtrat? Če da, koliko? Je to validirano?
  • Laboratorijska steklovina: Ali obvladujemo čiščenje laboratorijske steklovine? Ali je postopek čiščenja validiran? Pralna sredstva in njihovo menjavanje? Hranjenje laboratorijske steklovine? Možnost kontaminacije?
  • Viale in septe: Kakovostne, od znanih dobaviteljev? Pranje vial: ali je to za nas sploh sprejemljivo? Ali pogosto menjamo dobavitelje?

Gotovo so nekatera od zgornjih vprašanj za marsikoga prav pikolovska in bo morda samo zamahnil z roko, vendar izkušnje kažejo, da so problemi z dodatnimi vrhovi možni v vseh teh točkah.

Vseeno pa predlagam, da si najprej odgovorite na naslednja vprašanja, preden greste v akcijo:

  • Ali sploh analiziramo snovi v nizkih koncentracijah?
  • Ali delamo pri nizkih valovnih dolžinah (UV= pod 230 nm) ali pri drugih zelo občutljivih načinih detekcije (npr. flourescenca)?
  • Ali pri analizi nizkih koncentracij uporabljamo gradientno analitiko?

Če ste si na na ta vprašanja odgovorili z DA, se vam lahko “zgodijo” dodatni vrhovi, za katere boste morali dokazati od kod prihajajo (če delate v farma industriji!). Več kot je DA-jev in bolj kot greste v skrajnosti, večja je možnost za problem. Ocenite sami!

Rešitve?

Kar na dlani se ponujajo: zagotavljanje čistoče v laboratoriju, validirani procesi in dobra organizacija laboratorijskega dela. Naporno!

Aleš Čerin

Kliknite in delite naprej: bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark

Sorodne vsebine