HPLC seminarja: nekaj teorije in veliko praktičnega dela

23. oktober 2008 · Objavljeno v Analitika · 4 komentarjev, komentirajte še vi. 

Seminarja HPLC-Praktičen pristop in HPLC-Reševanje in preprečevanje težav, ki ju skupaj organiziramo že tretje leto zapored (2 termina na leto) Instrumentalia d.o.o., LabTim d.o.o. in Edusatis d.o.o., sta bil spet polna.

Kot vedno smo se malo ukvarjali s teorijo, še več pa s praktičnim delom na pravih, delujočih HPLC sistemih. Nekatere so naši serviserji namerno pokvarili in udeleženci so jih morali “spraviti v red”.

Udeležencem smo dali razvijati preprosto metodo za določanje kofeina v naravnih (kava, mate čaj, pravi čaj) in “mehkih” (Coca Cola, Red Bull, M-150) pijačah. S pomočjo nas trenerjev so udeleženci v kratki uri razvili HPLC metodo, predvsem pa so udeleženci spoznali pristop k razvoju metode in principe, ki jih je treba pri tem upoštevati. Zanimivo, da sta dve skupini, z dvema različnima metodama, z relativno slabim (netočnim - namerno!) redčenjem, dobili zelo primerljive rezultate. Glej sliko.
Rezultati: Skupina 1, Skupina 2
Rezultati so podani v mg kofeina/na dozo, ki jo zaužijemo: čaj, mate čaj: na200 ml; kava: na 100 ml; Coca-Cola: na 500 ml; Red Bull: na 250 ml; M-150: na 150 ml.

Pri seminarju, kjer rešujemo HPLC probleme in navdušujemo udeležence za preprečevanje, so udeleženci popravljali izjemno slabo razvito (namerno seveda) HPLC metodo za določanje konzervansov v kremi. Pri tem smo dobivali občutek za premike substanc z različnimi mobilnimi fazami, kako zmanjšati pritisk, kako se “znebiti” (raziskati) dodatnega vrha v kromatogramu, … Udeleženci so dobili “občutek” za HPLC metodo in kateri so vplivi na posamezne parametre.

Seveda pa vsakemu našemu seminarju sledi delavnica “Prinesi svoj problem”. S pomočjo metode odprtega prostora, rešujemo probleme, ki jih udeleženci prinesejo s seboj ali se jih domislij kar na izobraževanju. prvi dan se je razpava potegnila (pač v skladu s principom: “Če ni konec, pa ni konec.” do poznih večernih ur. Imeli smo kar kratko delavnico integriranja kromatogramov.

Udeležencem se zahvaljujemo za izjemno aktivno sodelovanje in pripravljenost. Povabljeni k komentiranju.

Aleš Čerin

Kliknite in delite naprej: bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark

Sorodne vsebine

HPLC kolone: Ali imamo svoj test za kolone?

5. maj 2008 · Objavljeno v Analitika, Kakovost · Komentar 

Ni je bolj “tečne” stvari, kot če se zgodi, da je analiza “super nujna” - kar je skoraj vedno, nam pa ločitev ne ustreza.

Ali pa, pritisk na koloni je previsok. Ali pa, zamaknjeni retencijski časi. Ali pa, dodatni vrhovi, ki se lepo počasi valijo iz kolone. Ali pa … še bi se dalo naštevati. Naša reakcija - zamenjaj kolono - ni vedno možna. Pač nimamo na zalogi enake kolone. Drugo podobno kolono v reguliranem okolju pa ni dovoljeno kar tako uporabiti.

Test kolon

Tako radi krivdo za neustrezno ločitev naprtimo koloni. Sam bi sicer najprej posumil na druge možnosti. Predvsem pa bi pogledal na zapise o obnašanju kolone v preteklosti. Ali sploh imamo take zapise? Ali pravzaprav sploh vemo kako se obnaša cevka, ki jo imamo vpeto v sistem? Ali imamo svoj test kolone, ki bi nam še pred prvo uporabo kolone pokazal njene značilnosti? Ali pa imamo samo test proizvajalca, ki je seveda idealiziran in večinoma neprimeren za naše okolje? In od vsakega proizvajalca dobimo malo drugačen test …

Pomislimo, kakšen test bi bil primeren za naše okolje in ki bi nam prinesel največ koristnih informacij. V celotnem “življenskem krogu” kolone. Predlagam, da razvijete svoj test za kolone, ki bo za vas ustrezen, za vašo analitiko, za vaše spojine, za vaš način dela.

Prednosti testa

Prva prednost: Predlagam, da že pred prvo uporabo kolono testirate z vašim testom, da boste vedeli kako se obnaša. Lahko jo boste primerjali z drugimi serijami enakih kolon. Veliko proizvajalcev zagotavlja ponovljivost med različnimi serijami stacionarne faze. Če kolone ne bodo zadovoljivo ponovljive, jih boste lahko reklamirali. To je ena prednost testa.

Druga prednost je ta, da vsakič, ko ločitev pri rutinskem testu ni ustrezna, primerjate na nekaj neodvisnega od vaše metode. To vam bo v veliko pomoč pri grobem definiranju težav: analitika ali kaj drugega. Takoj lahko določite izvor problema:

  • Problem je kolona - če testiranje pokaže, da se je močno spremenila (npr.: retencijski časi testnih komponent so drugačni)
  • Problem je drugje (npr.: napačna mobilna faza, HPLC sistem, …).

Kakšen test?

Na kratko: tako enostaven, kot se da in primeren za vaše okolje. Samo kot primer predlagam naslednji test:

  • Mobilna faza: voda : metanol - 30 : 70 (v/v)
  • Pretok: 2,0 ml/min
  • Valovna dolžina: odvisno od substanc (okoli 254 nm, če se da)
  • Testne substance (najbolje, da jih določite sami iz svojega okolja): uracil (za merjenje praznega volumna v koloni), nepolarna komponenta (vaša ali npr. toluen) za merjenje hidrofobnih lastnosti kolone, bazična komponenta (vaša ali npr. piridin) za merjenje silanolnega efekta, kisla komponenta (vaša ali npr. fenol) za merjenje obnašanja kolone do kislih komponent.
  • OPOMBA: Lahko določite več komponet za vsako kategorijo, vendar ne pretiravajte. Za vsako področje največ dve!

Kaj meriti?

  • Kapacitivni faktor za vse komponente: merilo za obnašanje kolone za različne komponente, pri nepolarni komponenti - merilo za hidrofobne lastnosti kolone,
  • Faktor asimetrije za bazične komponente: merilo za silanolne lastnosti kolone
  • Retencijski čas uracila: merilo praznega prostora v koloni
  • Število teoretičnih prekatov (N): pokazatelj učinkovitosti kolone
  • Pritisk na koloni: merilo napolnjenosti, tudi blokade kolone

Kot povsod v življenju, je tudi v kromatografiji bolje preprečevati kot zdraviti. Dobro razvit in seveda redno uporabljan test je odlično orodje za oboje: za “zdravljenje” težav na HPLC in tudi za preventivo.

Želim vam veliko sreče pri razvoju testa.

Poročajte o rezultatih v vašem laboratoriju! Z veseljem bomo objavili.

Aleš Čerin

Kliknite in delite naprej: bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark

Sorodne vsebine

HPLC: O čistoči v laboratoriju …

22. april 2008 · Objavljeno v Analitika · Komentar 

HPLC je kompleksna analitska tehnika. Kljub izrednemu tehničnemu napredku, so težave na HPLC še vedno zanimiva tema kajne? Vedno je kaj, kar preseneti še tako izkušenega analitika.

Danes pa ne bom govoril o težavah na HPLC, pač pa o preprečevanju težav na HPLC. To je zelo široka tema. Pišem namreč o temi, za katero menim, da je osnova za preprečevanje težav na HPLC: o čistoči v laboratoriju. O njej se med kromatografisti ne govori veliko. Tudi sicer ne maramo preveč “sistemov za zagotavljanje čistoče” ali pa se z njimi sploh ne želimo ukvarjati.

Ta tema je še posebno pomembna ko analiziramo:

  • nizke koncentracije snovi,
  • pri nizkih valovnih dolžinah (UV detekcija) in še posebej pri
  • gradientni HPLC analitiki.

Dejstva: HPLC je kromatografska tehnika, ki ločuje komponente med seboj (ali pa tudi ne, včasih pripomnijo hudomušni). Na kromatogramu se vidi vse, kar naš detektor zazna. Tudi snovi, ki nekako “priletijo” v našo raztopino od kdovekod.

Od kod pa lahko “priletijo” neznani vrhovi?

Pomislimo na vse možnosti. Torej, vse kar je v stiku z našim vzorcem (ali standardom), ga lahko tudi onesnaži. S čim vse pa je v stiku vzorec in kaj se lahko zgodi?

Pa poglejmo vzorec (večina stvari velja tudi za standard) na poti od vzorčenja do kolone in si zastavimo zanimiva vprašanja:

  • Vzorčenje: S čim vzorčimo in v kaj vzorčimo (čistoča posod in pribora)? Ali je vzorec trden ali tekoč? Ali vzorec lahko kaj “potegne” iz posode v katero smo vzorčili?
  • Topilo za pripravo vzorca: Kakovost topil: ali lahko kaj prispevajo v raztopino, kar se vidi na kromatogramu? Čistoča posode za pripavo topila? Kje jo hranimo? Ali uporabljamo isto (ne samo enako!) topilo za standard in za vzorec?
  • Priprava vzorca: Ali preprečimo dostop prahu, da se useda na naš vzorec? V ilustracijo si poglejmo primer: Predstavljajte si zelo trde tablete, ki jih je pomočjo terilnice in pestila treba streti v fin prah. Treti je treba zelo intenzivno. Pri tem koščki tablet včasih dobesedno “skačejo” po okolici. Tudi v sosedovo terilnico, v kateri je imel zmlet svoj vzorec. In že imamo dodatne vrhove v kromatogramu.
  • Filtriranje: Ali imamo kakovostne filtre, ki ne odpuščajo? Kje jih hranimo? Ali jih hranimo zaprte, da se na njih ne nabira prah iz laboratorija? Ali zavržemo prvi filtrat? Če da, koliko? Je to validirano?
  • Laboratorijska steklovina: Ali obvladujemo čiščenje laboratorijske steklovine? Ali je postopek čiščenja validiran? Pralna sredstva in njihovo menjavanje? Hranjenje laboratorijske steklovine? Možnost kontaminacije?
  • Viale in septe: Kakovostne, od znanih dobaviteljev? Pranje vial: ali je to za nas sploh sprejemljivo? Ali pogosto menjamo dobavitelje?

Gotovo so nekatera od zgornjih vprašanj za marsikoga prav pikolovska in bo morda samo zamahnil z roko, vendar izkušnje kažejo, da so problemi z dodatnimi vrhovi možni v vseh teh točkah.

Vseeno pa predlagam, da si najprej odgovorite na naslednja vprašanja, preden greste v akcijo:

  • Ali sploh analiziramo snovi v nizkih koncentracijah?
  • Ali delamo pri nizkih valovnih dolžinah (UV= pod 230 nm) ali pri drugih zelo občutljivih načinih detekcije (npr. flourescenca)?
  • Ali pri analizi nizkih koncentracij uporabljamo gradientno analitiko?

Če ste si na na ta vprašanja odgovorili z DA, se vam lahko “zgodijo” dodatni vrhovi, za katere boste morali dokazati od kod prihajajo (če delate v farma industriji!). Več kot je DA-jev in bolj kot greste v skrajnosti, večja je možnost za problem. Ocenite sami!

Rešitve?

Kar na dlani se ponujajo: zagotavljanje čistoče v laboratoriju, validirani procesi in dobra organizacija laboratorijskega dela. Naporno!

Aleš Čerin

Kliknite in delite naprej: bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark bookmark

Sorodne vsebine